作者：劉逸宸、付巧妹（分別系中科院古脊椎所特別研究助理，研究員）

　　基因組三維結(jié)構(gòu)、類器官技術(shù)、微生物組學(xué)研究、大腦單細(xì)胞測(cè)序、癌癥疫苗……突飛猛進(jìn)的生物技術(shù)不僅推動(dòng)了科學(xué)研究的發(fā)展，也滲入我們生活的方方面面，影響著當(dāng)今人類的生活與健康。對(duì)此，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》發(fā)布特刊，專題討論最新生物技術(shù)的前沿和發(fā)展。中國(guó)科學(xué)院古脊椎動(dòng)物與古人類研究所（以下簡(jiǎn)稱“中科院古脊椎所”）付巧妹研究員受邀領(lǐng)銜古DNA前沿領(lǐng)域，針對(duì)古DNA技術(shù)的發(fā)展與未來(lái)撰寫(xiě)評(píng)述性文章（第一作者為中科院古脊椎所特別研究助理劉逸宸）。該論文于2022年7月21日在《細(xì)胞》雜志上在線發(fā)表。

　　重建已滅絕古人類——尼安德特人和丹尼索瓦人的全基因組、繪制全球人群遷徙交流歷史、挖掘最古老東亞現(xiàn)代人——“田園人”的遺傳結(jié)構(gòu)、揭示東亞人群末次盛冰期前后適應(yīng)性基因的變化、追溯中國(guó)南北方人群格局的形成、溯源南島語(yǔ)系人群的中國(guó)南方起源……在過(guò)去十余年里，研究人員利用古DNA技術(shù)發(fā)掘出那些遺落了成千上萬(wàn)年的遺傳信息，從中抽絲剝繭，不斷刷新我們對(duì)人類歷史的認(rèn)知。

　　那么，古DNA技術(shù)有什么樣的發(fā)展歷史和重大突破？目前的技術(shù)瓶頸和解決方案是什么？未來(lái)，古DNA技術(shù)如何發(fā)展？

　　一網(wǎng)打盡——高通量測(cè)序革新古DNA領(lǐng)域

　　高通量測(cè)序，又叫“二代測(cè)序”，是一種快速測(cè)定大量DNA序列的技術(shù)。在高通量測(cè)序普及之前，古DNA領(lǐng)域只能依賴PCR技術(shù)測(cè)定少數(shù)特定DNA片段的序列。這種方法獲取的DNA信息極其有限，而且難以區(qū)分真正的古DNA和污染DNA。高通量測(cè)序理論上能測(cè)序樣本中所有DNA分子的信息，且成本逐年降低。即使是含量極低的古DNA，也能很有效地對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。不僅如此，通過(guò)生物信息學(xué)手段（如mapDamage軟件），我們還能快速檢測(cè)樣本中是否存在古DNA損傷，從而達(dá)到鑒別古DNA的目的。這一方法，也成了領(lǐng)域中古DNA檢測(cè)的重要標(biāo)準(zhǔn)。

　　除此之外，研究人員還根據(jù)古DNA的特點(diǎn)，對(duì)高通量測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法（DNA文庫(kù)構(gòu)建）進(jìn)行了多種調(diào)整與優(yōu)化。其中，half-UDG處理和單鏈DNA文庫(kù)的構(gòu)建是最重要的兩項(xiàng)技術(shù)突破。Half-UDG技術(shù)既能保留部分DNA末端損傷，又能修復(fù)大部分古DNA損傷，從而在保留古DNA特征的同時(shí)，提高古DNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。單鏈DNA文庫(kù)則是針對(duì)古DNA中常常存在大量單鏈黏性末端的情況，直接將雙鏈DNA變性成單鏈DNA構(gòu)建文庫(kù)，從而更有效地測(cè)序受損的單鏈古DNA。

　　挑戰(zhàn)極限——DNA捕獲技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展

　　盡管高通量測(cè)序已能較為有效地測(cè)序古DNA，但由于古DNA提取物中常常包含大量污染DNA，使得測(cè)序的大部分DNA分子都是無(wú)用的信息，真正有用的古DNA序列常常只占測(cè)序數(shù)據(jù)的1%不到。對(duì)此，研究人員在古DNA領(lǐng)域研發(fā)應(yīng)用了DNA捕獲技術(shù)——通過(guò)設(shè)計(jì)DNA或RNA探針，像釣魚(yú)一樣把目標(biāo)古DNA從海量的污染DNA中“釣取”出來(lái)。這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于人類古基因組研究中，目前超過(guò)2/3的人類古基因組數(shù)據(jù)來(lái)自一個(gè)叫“1240k”的探針組的捕獲數(shù)據(jù)。

　　DNA捕獲技術(shù)不僅使得對(duì)古DNA的測(cè)序效率大大提高，還能有效從一些“棘手”的樣本中得到足夠的數(shù)據(jù)用以分析。一個(gè)典型的例子是去年發(fā)表在《細(xì)胞》雜志上的古代南方人群的基因組研究。中國(guó)南方溫暖潮濕的環(huán)境和當(dāng)?shù)氐乃嵝酝寥蓝疾焕诠臘NA的保存，使得這片區(qū)域的古DNA研究一度處于空白狀態(tài)。利用DNA捕獲技術(shù)，付巧妹團(tuán)隊(duì)成功獲取了30個(gè)古南方人群的基因組信息，揭示了一萬(wàn)余年以來(lái)東亞和東南亞交匯處的人群遺傳史。

　　最近，古DNA研究人員進(jìn)一步挑戰(zhàn)極限，他們脫離化石的桎梏，直接從“土”（沉積物）里提取古DNA。這項(xiàng)技術(shù)已成功應(yīng)用在丹尼索瓦洞和白石崖溶洞中，成功獲取了數(shù)萬(wàn)年前的已滅絕古人類的DNA。

　　未來(lái)可期——提升效率、拓寬視野、著眼當(dāng)今人類健康

　　雖然古DNA領(lǐng)域成果豐碩，但古DNA研究卻一直充滿了艱辛和挑戰(zhàn)。古DNA本身極易受到污染，其實(shí)驗(yàn)也極為精細(xì)，以往古DNA提取和建庫(kù)幾乎全程都依賴人工操作。最近，在全球少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，部分古DNA實(shí)驗(yàn)步驟成功整合到全自動(dòng)移液機(jī)器人平臺(tái)中，不僅極大節(jié)省了人力和物力，還減少了人工操作引入污染的風(fēng)險(xiǎn)。然而，目前樣品的前期處理步驟仍只能依賴人工，如何把這項(xiàng)耗時(shí)耗力的工作整合到自動(dòng)化體系中，是古DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)需要攻克的下一道難關(guān)。

　　另外，古DNA技術(shù)的應(yīng)用遠(yuǎn)不止于人類古基因組。通過(guò)古微生物DNA信息追溯古代疫病流行和共生微生物演化、利用古表觀遺傳學(xué)信息探究古代動(dòng)物和環(huán)境的相互作用，以及利用古蛋白質(zhì)探索更大時(shí)間尺度的人類演化，都是古分子研究的重要分支方向。如何更有效地獲取這些信息，并將信息進(jìn)行多維度結(jié)合，將是未來(lái)研究的難點(diǎn)之一。

　　古DNA是帶著時(shí)間刻度的遺傳信息，它從獨(dú)特的視角書(shū)寫(xiě)了人類數(shù)萬(wàn)年來(lái)的演化與適應(yīng)。這些歲月的痕跡不僅記錄了人類的遺傳歷史，還在持續(xù)地影響著現(xiàn)今人群的生理和健康。我們一些重要功能基因單倍型就推測(cè)來(lái)自已滅絕古人類，這些基因涉及先天免疫、脂代謝、高海拔適應(yīng)性、膚色、新冠重癥易感性等。還有關(guān)于我們東亞人群特有的與頭發(fā)和牙齒表型相關(guān)的基因型，也是在末次盛冰期之后頻率升高，推測(cè)與環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)。然而，還有很多很多古DNA研究發(fā)現(xiàn)的特殊基因型的功能還未能確定。在未來(lái)，可以通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型并結(jié)合基因編輯技術(shù)對(duì)這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)合古DNA技術(shù)與現(xiàn)代前言分子生物學(xué)技術(shù)，我們將能更清晰地理解演化史對(duì)我們當(dāng)今人類健康的影響。